MagCapture™ Exosome 격리 키트 PS Ver. 2
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포스파티딜세린과 Tim4를 이용한 엑소좀 정제 신기술
엑소좀 막에는 분비 세포에서 유래한 단백질과 지질이 포함되어 있다. 이러한 성분 중 포스파티딜세린(PS)은 지질 플리파아제의 효소 활성을 통해 온전한 세포의 세포막 내부에 배향되어 있으며, 엑소좀 막의 외부 표면에도 노출되어 있는 것으로 알려져 있다3). 또한, 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 식작용에 관여하는 수용체인 T세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 함유 단백질 4(Tim4)는 세포외 영역에 위치한 IgV 도메인을 통해 칼슘 이온 의존적인 방식으로 PS에 결합하는 것으로 알려져 있다.4)
이러한 연구 결과를 바탕으로, 우리는 리키나리 하나야마 교수와 공동으로5) Tim4가 고정화된 자성 비드(칼슘 이온이 존재하는 조건에서 배양 상청액 및 혈청과 같은 시료 내 엑소좀을 포획하고, 킬레이트제가 첨가된 완충액으로 용출하여 엑소좀을 분리할 수 있는)를 이용한 전례 없는 새로운 엑소좀 정제 방법을 개발했으며, 이를 바탕으로 자성 비드를 기반으로 한 엑소좀 정제 키트를 성공적으로 제작했습니다5). 이 엑소좀 정제 키트인 MagCapture™ Exosome Isolation Kit5)는 엑소좀의 특이적 포획 및 정제를 가능하게 하여, 엑소좀의 고순도 분리 및 분석에 기여합니다.5) (가나자와 대학 의학대학원 면역학과)와 협력하여 Tim4가 고정화된 자성 비드를 이용한 전례 없는 새로운 엑소좀 정제 방법을 개발하였으며, 이를 바탕으로 엑소좀 정제 키트를 성공적으로 구축했습니다5).
이 엑소좀 정제 키트인 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS는 기존의 어떤 엑소좀 정제 방법보다 높은 순도의 온전한 엑소좀을 손쉽게 정제할 수 있게 해줍니다. 현재 이 키트는 기존의 골드 스탠다드인 초원심분리법을 대체하는 새로운 엑소좀 정제 방법으로 자리매김하고 있습니다.
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2(V2.0 키트)는 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS(기존 키트)의 개선된 버전입니다. V2.0 키트는 회수 효율 향상, 반응 시간 단축, 세포 독성 감소를 실현했습니다.
세포외 소포 표면의 포스파티딜세린(PS)을 이용한 새로운 친화성 기반 방법
참고문헌
- Tkach, M. et al. Communication by Extracellular Vesicles : Where We Are and Where We Need to Go. Cell 164, 1226-1232(2016).
- Raimondo, F. et al. Advances in membranous vesicle and exosome proteomics improving biological understanding and biomarker discovery. Proteomics 11, 709-720(2011).
- Trajkovic, K. et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science 319(5867) : 1244-7(2008).
- Miyanishi, M. et al. Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor. Nature 450, 435-439(2007).
- Nakai, W. et al. A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci. Rep. 6, 33935(2016).
주요 기능
-
새로운 친화성 분리법
- PS 결합 분자를 이용한 분리※
- 낮은 배경 신호
- 중성 pH 조건에서 킬레이트 시약을 이용한 온화한 용출
※PS 친화성 방법을 통해 고순도 엑소좀을 쉽게 분리할 수 있습니다.
고순도 및 온전한 엑소좀
-
초원심분리 불필요
- 자기 비드를 이용한 간편한 조작
- 최적화된 프로토콜
높은 재현성
다른 정제 방법과의 비교
| 방법 | 엑소좀 순도 | 회수량 | 무결성 여부 | 총 단백질 수율 |
|---|---|---|---|---|
| MagCapture™ (PS 친화성 방법) |
■ ■ ■ ■ | ■ ■ ■ | 예 | ■ |
| 초원심분리 | ■ ■ | ■ ■ | 예 | ■ ■ ■ |
| 고분자 기반 침전 | ■ | ■ ■ | 예 | ■ ■ ■ ■ |
| 밀도 구배 원심분리법 | ■ ■ ■ | ■ | 예 | ■ ■ |
| 크기 분획법 | ■ ■ ■ | ■ ■ | 예 | ■ ■ |
| 엑소좀 표면 항원 친화도법 (항체 사용) |
■ ■ ■ | ■ ■ | 아니요 | 데이터 없음 |
※이 비교표는 당사의 자체 조사를 바탕으로 작성되었습니다. 결과는 시료, 검출 대상 및 방법에 따라 달라질 수 있으므로 각 방법의 성능이 보장되지는 않습니다.
대상 시료: 세포 배양 상청액, 혈청, 혈장, 소변 등.
기존 키트와 V2.0 키트 비교
| MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS ver.2 (V2.0 키트) | MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS (기존 키트) | ||
|---|---|---|---|
| 회수량 | 배양 상청액 | ■ ■ ■ ■ | ■ ■ ■ |
| 혈액 시료 | ■ ■ ■ ■ | ■ ■ ■ | |
| 반응 시간*1 | 1시간 이상 | 3시간 이상 | |
| 재사용 가능 횟수*2 | 5회 | 5회 | |
| 용출 완충액의 세포 독성*3 | 낮음*4 (기존 키트 대비) | 세포주에 따라 다름 | |
*1: 반응 시간은 시료의 부피에 따라 달라집니다.
*2: 5회 = 최초 사용 1회 + 재사용 4회 [출처가 다른 시료를 사용하거나 오염 위험이 있는 경우, 새로운 자성 비드를 사용하는 것을 권장합니다.]
*3: 용출 완충액 = 키트에 포함된 엑소좀 용출 완충액.
*4: 용출 완충액을 변경하지 않고도 투여 실험(체외 또는 생체 내)을 수행할 수 있습니다. [용출 완충액에 포함된 EDTA로 인해 문제가 발생할 경우, 완충액 교체를 권장합니다.]
다양한 시료에 대한 전처리 프로토콜
이 섹션은 시료 전처리에 관한 내용입니다. 엑소좀 및 기타 대형 엑소좀(마이크로베시클)이 필요한 경우, 1,200 x g 상층액※1을 시료로 준비하십시오.
또한, 고순도 엑소좀이 필요한 경우, 10,000 x g 상층액※2을 시료로 준비하십시오. 이 시료 전처리 프로토콜은 세포 배양액, 혈청 및 혈장을 대상으로 설정되어 있습니다. 다른 체액을 사용할 경우, 혈청 및 혈장용 프로토콜을 참조하여 적절한 전처리 프로토콜을 확인하시기 바랍니다.
※1 엑소좀 및 대형 엑소좀(EV)이 필요한 경우, 1,200 x g 상층액을 시료로 사용하십시오.
※2 엑소좀이 필요한 경우, 10,000 x g 상층액을 시료로 사용하십시오.
※3 대형 EV가 필요한 경우, 10,000 x g에서 원심분리하여 얻은 대형 EV를 TBS에 현탁시킨 후, ppt를 시료로 사용하십시오.
※4 농축 단계는 대용량(~ 50 mL)의 세포 배양 상청액을 정제 시료로 사용할 때 선택 사항입니다. 그러나 회수 효율이 향상되므로 가능한 한 수행하시기 바랍니다.
※5 EV-Save™에는 고분자가 포함되어 있으므로, 단백질체학 분석 시료의 준비에는 사용을 권장하지 않습니다.
참고: 시료의 양이 많거나 적은 경우
시료 양이 많은 경우
세포 배양 상청액(약 50 mL)을 정제용 시료로 사용할 때는 시료를 농축하는 것이 권장됩니다. 회수 효율이 향상되므로 가능한 한 이 과정을 수행해 주십시오.
소량 시료의 경우
Exosome Capture 고정화 비드와 시료의 혼합을 최적화하기 위해, 시료에 적절한 양의 TBS를 첨가하여 총 부피를 0.5 mL로 맞추십시오. (예: 100–200 μL → 500 μL)
참고 데이터: 엑소좀 및 대형 엑소좀(large EVs)의 NTA 분석
모넨신 나트륨염으로 엑소좀 분비를 유도한 후 수집한 K562 세포 배양 상청액 1 mL를 10,000 x g에서 원심분리하여 상층액과 침전물(TBS 1 mL에 현탁) 분획을 분리했습니다.
그 후, MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS를 사용하여 두 분획에서 세포외 소포를 정제하고 NanoSight LM10을 사용하여 분석했습니다.
MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS (일반 키트)
MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS 사용 절차 개요
키트 구성품
| 2회 분량 | 10회 분량 | |
|---|---|---|
| 스트렙타비딘 자성 비드 | 120 μL x 1 튜브 | 600 μL x 1 튜브 |
| 비오틴 표지 엑소좀 포집 | 20 μL x 1 튜브 | 100 μL x 1 튜브 |
| 엑소좀 포획 고정화 완충액 | 7 mL x 1 튜브 | 35 mL x 1 튜브 |
| 엑소좀 결합 증강제 (500배) | 100 μL x 1 튜브 | 500 μL x 1 튜브 |
| 세척 완충액 | 30 mL x 1 튜브 | 75 mL x 2 튜브 |
| 엑소좀 용출 완충액 | 1 mL x 1 튜브 | 5 mL x 2 튜브 |
| 반응 튜브 | 4 튜브 | 22 튜브 |
응용 데이터
혈청/소변 시료에서 정제된 세포외 소포 분석
비교
엑소좀의 단백질체학 분석
단백질 농도 측정
HeLa 세포를 이용한 엑소좀 표지 및 흡수 분석
혈청/소변 시료에서 정제된 세포외 소포 분석
인간 정상 혈청에서 분리된 엑소좀의 수율 비교
MagCapture™, 초원심분리 및 엑소좀 표면 항원에 대한 항체를 이용한 친화성 분리법을 통해 정상 인간 혈청에서 엑소좀을 분리하고, 이후 anti-CD9 및 anti-CD63 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
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레인 1: 초원심분리 레인 2: MagCapture™ 레인 3: CD9 항체가 포함된 엑소좀 분리 시약 [공급업체 A] 레인 4: CD63 항체가 포함된 엑소좀 분리 시약 [공급업체 A] 레인 5: CD81 항체가 포함된 엑소좀 분리 시약 [공급업체 A] 레인 6: 항체가 포함된 엑소좀 분리 시약 [공급업체 A] (항체 비드 - CD9, CD63, CD81 및 EpCAM 혼합물) |
검출 항체Anti-CD9 토끼 다클론 항체, System BioscienceAnti-CD63 토끼 다클론 항체, System Bioscience WB 데이터에 관하여각 신호는 150 μL의 혈청 시료에 해당합니다. 15 μL의 용출액과 5 μL의 4× SDS 시료 완충액을 혼합하여 각 웰에 모두 도포했습니다. |
MagCapture™를 이용한 엑소좀 회수율은 초원심분리법 및 항체 기반 방법보다 높습니다.
인간 정상 소변에서 분리된 엑소좀의 회수율 비교
MagCapture™, 초원심분리 및 고분자 기반 침전법을 사용하여 정상 인간 소변에서 엑소좀을 분리하고, 이후 항-CD9 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다.
마커 단백질의 회수량 비교
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레인 1: 고분자 기반 침전법 레인 2: 초원심분리법 레인 3: Mag Capture™ |
검출 항체Anti-CD9 토끼 pAb, System Bioscience시료 부피각 1 mLWB 데이터 정보각 신호는 150 μL의 소변 시료에 해당합니다. 15 μL의 용출액과 5 μL의 4× SDS 시료 완충액을 혼합하여 각 웰에 모두 도포했습니다. |
NTA
비교
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입자 크기 분포평균: 176 ± 1.6 nm최빈값: 117 ± 4.5 nm 표준편차: 96 ± 5.8 nm |
입자 크기 분포평균: 191 ± 9.4 nm최빈값: 113 ± 2.8 nm 표준편차: 88 ± 7.4 nm |
입자 크기 분포평균: 107 ± 1.2 nm최빈값: 86 ± 1.2 nm 표준편차: 42 ± 1.0 nm |
소변 검체에서 고순도 엑소좀을 분리할 수 있다.
배양 상청액 샘플에서 정제된 세포외 소포 분석
MagCapture™, 초원심분리 및 고분자 기반 침전법을 사용하여 K562(인간 만성 골수성 백혈병: CML) 세포 배양 상청액(무혈청 배지 또는 엑소좀이 제거된 10% FBS 배지)에서 분리된 엑소좀의 수율과 순도를 비교했습니다.
MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS
PS 친화법 표준 프로토콜(반응 시간: 3시간)
을 사용하여, 전처리된(10,000 × g, 30분) K562 세포 배양 상청액 1 mL(무혈청 배지 또는 10% 엑소좀 제거 FBS※1 포함 배지)에서 엑소좀을 회수하였다
초원심분리
전처리된(10,000 × g, 30분) K562 세포 배양 상청액 10 mL (무혈청 배지 또는 10% 엑소좀 제거 FBS※1 포함 배지)를 110,000×g, 70분 동안 초원심분리하고, 침전물을 TBS로 재현탁시켰다. 그 후, 현탁액을 다시 초원심분리하여 침전된 펠릿을 엑소좀 시료로 회수하였다.
고분자 기반 침전법
전처리된 (10,000 × g, 30분) K562 세포 배양 상청액(무혈청 배지 또는 10% 엑소좀 제거 FBS※1가 포함된 배지)에서 공급업체 A의 제품을 사용하여 설명서에 따라 엑소좀을 회수하였다(침전 시간: 하룻밤).
※1: 110,000 × g에서 2시간 동안 원심분리하고, 침전물을 포함하지 않도록 상층액을 회수하였다.
분리된 엑소좀의 전자현미경 분석 및 나노 분석
MagCapture™를 이용한 K562 세포 배양 상청액(무혈청 배지) 유래 엑소좀의 입자 크기는, 초원심분리 및 고분자 기반 침전법을 각각 사용하여 분리된 엑소좀의 입자 크기를 NanoSight LM-10을 사용하여 측정했습니다. 수집된 엑소좀(2–4 × 1010 입자)은 2% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 전자 현미경으로 분석했습니다.
전자 현미경 이미지는 가나자와 대학 의학대학원의 R. 하나야마 박사와 오사카 대학 iFReC의 나카이 박사가 제공했습니다.
MagCapture™를 통해 크기가 약 50~100 nm인 많은 입자가 수집되었습니다. 전자 현미경 관찰 결과, 수많은 세포외 소포가 확인되었습니다.
엑소좀(무혈청)의 회수량 및 순도 비교
K562 세포(무혈청 배지)의 세포 배양 상청액에서 MagCapture™, 초원심분리 및 고분자 기반 침전법을 통해 엑소좀을 회수하였다. 회수량과 순도는 은염색 및 anti-CD63, anti-Flotillin-2, anti-Lamp-1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가하였다.
MagCapture™를 사용하면 엑소좀의 회수율이 뛰어나고 단백질 오염 물질의 양이 매우 적어, 순도와 회수량 간의 균형이 가장 우수합니다.
엑소좀의 회수량 및 순도 비교 (엑소좀이 10% 제거된 FBS 포함 배지)
K562 세포의 세포 배양 상청액(엑소좀이 10% 제거된 FBS가 포함된 배지)에서 MagCapture™, 초원심분리 및 고분자 기반 침전법을 통해 엑소좀을 회수했습니다. 회수량과 순도는 은염색 및 항-CD63, 항-Lamp-1, 항-Flotillin-2 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석했습니다. 또한, 각 방법으로 회수된 시료를 질량 분석법으로 분석하여 K562 세포 유래 인간 펩타이드의 비율을 비교했습니다.
MASS 분석 데이터는 가나자와 대학 의학대학원의 R. Hanayama 박사와 오사카 대학 iFReC의 W. Nakai 박사가 제공했습니다.
MagCapture™를 사용하면 FBS가 포함된 배양액에서도 고순도 엑소좀을 회수할 수 있으므로, 낮은 배경 신호로 MASS 분석을 수행할 수 있습니다.
비교
정상 인체 혈청 유래 엑소좀에서 회수된 마이크로RNA 및 mRNA 양의 비교
서로 다른 기법으로 조제된 엑소좀에서 회수된 마이크로RNA 및 mRNA 양의 비교
초원심분리법 및 PS 친화성 방법을 통해 정상 인체 혈청 시료에서 엑소좀을 분리한 후, microRNA Extractor SP Kit(제품 번호 295-71701)를 사용하여 RNA를 회수했습니다. microRNA(let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p) 및 mRNA(GAPDH, PIK3CB)를 정량 PCR을 통해 측정하고 Ct 값을 이용하여 비교하였다.
PS 친화성 방법으로 분리된 엑소좀에서는 초원심분리법으로 분리된 엑소좀보다 microRNA와 mRNA가 더 효율적으로 회수되었다.
PS 친화성 분획물로부터의 RNA 추출 방법 비교
PS 친화성 방법을 통해 정상 인간 혈청 샘플에서 엑소좀을 분리한 후, microRNA Extractor SP Kit(제품 번호 295-71701) 또는 산성 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출법(AGPC법)을 사용하여 RNA를 회수했습니다. microRNA(let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)와 mRNA(GAPDH, PIK3CB)는 정량 PCR을 통해 측정하고 Ct 값을 기준으로 비교했습니다.
AGPC 법보다 microRNA Extractor SP Kit를 사용하여 엑소좀에서 microRNA와 mRNA를 더 효율적으로 회수할 수 있었다.
엑소좀의 프로테오믹스 분석
실험 설명 및 결과
엑소좀이 포함되지 않은 FBS 10%를 함유한 K562 세포 배양 상청액에서 PS 친화도법, 초원심분리법 또는 중합체 침전법을 사용하여 엑소좀을 정제했습니다. 획득한 엑소좀 시료는 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 개별 전체 단백질 밴드를 잘라냈다. 겔 내 소화 후, 단백질은 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 통해 동정되었다. 3가지 다른 방법(각 방법당 n=3)으로 정제된 엑소좀 제제에서 동정된 단백질에 대해서도 쌍별 상관관계를 비교하였다.
MASS 분석을 통해 확인된 상위 10개 단백질의 비교
흰색 기둥: 엑소좀(EVs) 유래 인간 단백질
회색 기둥: FBS 유래 소 단백질 오염 물질
빨간색: 엑소좀(EVs)의 마커 단백질
시료: K562 세포 배양액 (엑소좀이 제거된 FBS 10% 포함)
| PS 친화성 | 초원심분리 | 고분자 침전 | |
|---|---|---|---|
| 1 | 열충격 관련 71 kDa 단백질 | DNA 의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛 | 보체 C3 |
| 2 | 아넥신 A6 | 트랜스페린 수용체 단백질 1 | 알파-2-마크로글로불린 |
| 3 | 트랜스페린 수용체 단백질 1 | 혈청 알부민 | 피브로넥틴 |
| 4 | V형 양성자 ATP아제 촉매 서브유닛 A | ATP 의존성 RNA 헬리카제 A | 혈청 알부민 |
| 5 | 플로틸린-2 | 튜불린 베타-5 사슬 | 트롬보스폰딘-1 |
| 6 | 프로그램된 세포 사멸 6 상호작용 단백질 | 열충격 동종 71 kDa 단백질 | 보체 C4 |
| 7 | 4F2 세포 표면 항원 중쇄 | 지방산 합성효소 | 알파-1-항프로테아제 |
| 8 | 아넥신 A1 | 4F2 세포 표면 항원 중쇄 | 아포지단백 B-100 |
| 9 | 220 kDa 키나제 D 상호작용 기질 | U5 소핵 리보핵단백질 헬리카제 | 태아 헤모글로빈 베타 서브유닛 |
| 10 | 아넥신 A2 | 튜불린 베타-4B 사슬 | 튜불린 베타-5 사슬 |
폴리머 침전법을 통해 얻은 엑소좀 정제물에는 소 혈청 유래 단백질이 더 많이 포함되어 있지만, PS 친화성 방법을 통해 얻은 엑소좀 정제물에서는 더 많은 엑소좀 마커 단백질이 확인됩니다.
쌍별 상관관계 비교
시료: K562 세포 배양액 (엑소좀이 제거된 FBS 10% 포함)
| 재현성 | |
|---|---|
| 초원심분리(UC) | 낮음 |
| 고분자 침전 | 높음 |
| PS 친화성 | 높음 |
참고 문헌: Sci Rep. 2016년 9월 23일;6:33935. Nakai W 등.
고분자 침전법과 PS 친화도법은 높은 방법 내 상관관계를 보이는 반면, 초원심분리법의 방법 내 상관관계는 다소 낮습니다. 서로 다른 방법 간의 상관관계는 상대적으로 낮습니다. 정제 방법에 따라 서로 다른 엑소좀 집단이 생성될 수 있습니다.
단백질 농도 측정
Protein Assay BCA 키트를 이용한 엑소좀 내 단백질 농도 측정
비친코닌산(BCA)을 사용하여 용액 내 총 단백질 농도를 측정할 수 있는 Protein Assay BCA 키트는 가장 널리 사용되는 단백질 측정 키트입니다. 이 키트는 염기성 조건에서 단백질에 의해 Cu2+가 Cu+로 환원되는 원리에 기반합니다. Cu+와 BCA 간의 킬레이트 형성으로 보라색 킬레이트가 생성됩니다. 단백질 농도가 높아질수록 보라색이 더 짙어지므로, 562 nm에서 측정된 이 흡광도를 다양한 농도의 소 혈청 알부민(BSA)으로 얻은 표준 흡광도 곡선과 비교하여 단백질 농도를 측정합니다.
여기서는 MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS를 사용하여 세포 배양 상청액에서 정제한 엑소좀 시료의 단백질 농도를, 단백질 정량 BCA 키트의 고감도 프로토콜에 따라 측정했습니다.
실험 설명 및 결과
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS를 사용하여 정제한 엑소좀 용액을 25 μL씩 96웰 플레이트에 분주한 후, Protein Assay BCA Kit에 포함된 시약 A와 시약 B의 혼합물 200 μL를 각 웰에 첨가했다. 이후 60℃에서 30분간 반응시킨 후, 560 nm에서 흡광도를 측정했습니다(그림 1). 그 결과, 정제된 엑소좀 시료의 단백질 농도를 Protein Assay BCA Kit의 고감도 프로토콜을 사용하여 측정할 수 있음이 확인되었습니다.
그림 1. 단백질 분석 BCA 키트를 사용하여 결정한 BSA 교정 곡선 및 정제된 엑소좀 준비물의 단백질 농도 측정 결과
BCA 분석 프로토콜 개요
엑소좀 준비물의 단백질 농도가 상당히 낮으므로, BCA 단백질 분석에는 희석하지 않은 시료를 사용하십시오.
- 96웰 플레이트의 각 웰에 표준 BSA 용액(250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 μg/mL)과 표준 BLANK를 25 μL씩 피펫팅합니다.
- 정제된 엑소좀 시료와 용출 완충액(BLANK)을 96웰 플레이트의 각 웰에 25 μL씩 피펫팅합니다.
- Protein Assay BCA Kit(제품 번호: 297-73101)의 시약 A와 시약 B(A:B = 50:1)를 혼합한 용액을 각 시료가 들어 있는 웰에 200 μL씩 첨가합니다.
- 플레이트를 60 ℃에서 30분 동안 배양합니다.
- 플레이트를 실온에서 식힙니다.
- 560 nm에서 흡광도를 측정합니다.
HeLa 세포를 이용한 엑소좀 표지 및 흡수 분석
실험 개요
MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS로 정제된 엑소좀을 PKH67(Sigma)로 표지하고, HeLa 세포에 흡수되는 능력을 확인했습니다.
PKH67을 이용한 엑소좀 표지
- MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS를 사용하여 엑소좀을 정제합니다(실험 당일 COLO201 세포 배양 상청액에서 추출).
* 6~7단계 젤 여과 과정에서 흡착으로 인한 표지된 시료의 손실을 방지하기 위해, 키트에 포함된 용출 완충액에 EV-Save™ 세포외 소포 차단 시약을 첨가하는 것이 권장됩니다. EV-Save™가 포함된 용출 완충액을 사용하면 시료 손실을 최소화하여 시료를 준비할 수 있습니다. - BCA 분석법과 NanoSight를 사용하여 단백질 농도와 입자 농도를 측정합니다.
- 단백질 3 μg*에 해당하는 엑소좀 시료 용액을 1.5 mL 튜브에 분주합니다.
* 실험에 필요한 적정량을 준비하십시오. - 2.0 μL의 PKH67 링커를 0.25 mL의 희석제 C(PKH67 키트에 포함) - 4x 염료 용액*에 용해시키십시오.
* 실험에 필요한 적정량을 준비하십시오. - 엑소좀 시료에 4× 염료 용액의 부피의 1/3을 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5~10분간 반응시킵니다.
- 제품에 동봉된 프로토콜에 따라 엑소좀 스핀 컬럼(MW 3000) (Thermo #4484449)을 PBS로 평형화합니다.
- 위에서 설명한 대로 평형화된 각 스핀 컬럼*에 각 시료 100 μL를 도포하고, 750 x에서 2분간 원심분리하여 결합되지 않은 염료와 표지된 엑소좀을 분리합니다.
* 컬럼당 최대 로딩 용량이 100 μL이므로, 시료량이 100 μL를 초과하는 경우 시료 용량에 상응하는 여러 개의 컬럼을 준비해 두는 것이 좋습니다. - 표지된 엑소좀*이 포함된 용액을 전날 접시에 접종해 둔 HeLa 세포에 첨가합니다. 24시간 후, 현미경 관찰 및 유세포 분석을 수행합니다.
* 첨가하는 엑소좀의 양을 조절하십시오.
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현미경 관찰 결과
-
유세포 분석 결과
그림 1. HeLa 세포로의 PKH 표지 엑소좀 흡수 관찰. 엑소좀은 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS를 사용하여 COLO201 세포 배양 상청액에서 분리하였으며(총 단백질 3 μg, 입자 수 1 × 1010), 이후 PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma)를 사용하여 표지했습니다. 표지된 엑소좀의 HeLa 세포 내 흡수는 형광 현미경(왼쪽) 및 유세포 분석(오른쪽)을 통해 확인되었습니다.
이제 현미경 이미지와 유세포 분석 차트 모두에서 PKH67로 표지된 엑소좀이 내포작용을 통해 세포 내로 흡수되는 것을 확인할 수 있습니다. 또한, 시료에 EV-Save™ 세포외 소포 차단 시약을 첨가함으로써 염료 제거 단계에서 겔 여과 컬럼에 의한 흡착으로 인한 손실을 현저히 줄일 수 있음을 알 수 있습니다.
MagCapture™ 엑소좀 분리 키트 PS Ver.2 (V2.0 키트)
V2.0 키트와 기존 키트의 차이점*1
*1: 기존 키트 = MagCapture™ Isolation Kit PS (제품 번호 293-77601)
- 엑소좀 회수 효율 향상
- 실험 시간 단축
친화성 반응 시간이 1시간으로 단축되었습니다! (기존 키트는 3시간이 소요됨) - 세포 독성 감소
버퍼 교환이 필요 없음
V2.0 키트 실험 절차 개요*2
*2: V2.0 키트 = MagCapture™ Isolation Kit PS Ver.2 (품번 290-84103)
키트 구성품
| 2회 검사분 | 10회 검사분 | |
|---|---|---|
| 비오틴 포집 자성 비드 | 120 μL | 600 μL |
| 비오틴 표지 엑소좀 포집 | 20 μL | 100 μL |
| 엑소좀 고정화/세척 완충액 (10배 농축) | 5 mL | 25 mL |
| 엑소좀 결합 증진제 (500배 농축) | 300 μL | 1500 μL |
| 엑소좀 용출 완충액 (10배 농축) | 300 μL | 1500 μL |
| 반응 튜브 | 4개 | 22개 |
기존 키트와의 비교
엑소좀 회수 효율: 혈청 및 혈장
엑소좀 회수 효율: 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 상청액
정제된 엑소좀의 세포 독성
엑소좀 회수 효율: 혈청 및 혈장
인간 혈청 및 혈장의 세포외 소포(EV)를 기존 키트 또는 V2.0 키트를 사용하여 분리 및 정제했습니다. 그 후, 1~3번의 분석을 진행했습니다.
- PS Capture™ 엑소좀 ELISA 키트를 이용한 EV 마커 비교
- 웨스턴 블롯을 이용한 EV 마커 비교
- Nanosight를 이용한 입자 수 측정
V2.0 키트에는 엑소좀 용출 완충액(10×)이 포함되어 있습니다. 이 분석에서는 1× 용출 완충액과 2× 용출 완충액을 평가했습니다.
그 결과, 인간 혈액 시료의 경우 V2.0 키트는 기존 키트와 동등한 성능을 보였습니다. 특히 혈장 시료에서 EV의 회수 효율은 2× 용출 완충액을 사용했을 때 향상되었습니다.
1. EV 마커 비교 (PS Capture™ 엑소좀 ELISA 키트)
2. EV 마커 비교 (웨스턴 블롯)
▷검출 항체: Anti CD9, 쥐 단일클론 항체 (77B) (코드 번호 019-28173)
▷검출 항체: Anti CD63, 단일클론 항체 (3-13) (코드 번호 012-27063)
▷검출 항체: Anti Flotillin2, 단일클론 항체 (BD)
3. Nanosight를 이용한 입자 수 측정
엑소좀 회수 효율: 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 상청액
MSC 배양 상청액에서 유래한 엑소좀(EVs)을 기존 키트 또는 V2.0 키트를 사용하여 분리 및 정제했습니다. 그 후, 1~3번의 분석을 수행했습니다.
- PS Capture™ 엑소좀 ELISA 키트를 이용한 엑소좀 마커 비교
- 웨스턴 블롯을 이용한 엑소좀 마커 비교
- Nanosight를 이용한 입자 수 측정
그 결과, V2.0 키트의 EV 회수 효율이 기존 키트보다 높은 것으로 나타났습니다.
1. PS Capture™ 엑소좀 ELISA 키트를 이용한 EV 마커 비교
정제된 엑소좀의 세포 독성
COLO201 배양 상청액에서 유래한 엑소좀(EVs)을 기존 키트 또는 V2.0 키트를 사용하여 분리 및 정제하였다. 동일한 양의 정제된 엑소좀과 엑소좀 용출 완충액을 인간 정상 섬유아세포에 첨가했습니다. 48시간 후, 기존 키트의 경우 세포 형태학적 변화와 세포 사멸이 관찰되었으나, V2.0 키트에서는 이러한 변화가 나타나지 않았습니다. 따라서 V2.0 키트는 완충액 교환 없이도 (체외 또는 생체 내) 흡수 실험에 사용할 수 있습니다*3.
*3: 용출 완충액에 포함된 EDTA로 인해 문제가 발생할 경우, 완충액 교환을 권장합니다.
Special Contents
사용자 후기Voice
“이 키트는 제가 지금까지 시도해 본 엑소좀 분리 방법 중 가장 성공적이었습니다.”
바이오의약품 기업 | 시료: 중간엽 줄기세포
“배경 잡음이 적어서 글리칸 분석이 성공적으로 이루어졌습니다. 이 키트는 우리 연구실의 주요 연구 주제 중 하나인 엑소좀을 규명하는 데 기초를 마련해 주었습니다.”
대학-의과대학 | 시료: 인체 소변
“저희는 이 키트로 분리된 혈청 유래 엑소좀에서 질병 마커 단백질을 발견했습니다.”
대학-의과대학 | 시료: 인간 혈청
“이 키트를 사용하면 시료에 따라 다른 엑소좀 분리 방법과 비교했을 때 엑소좀의 순도가 매우 높습니다.”
암 연구 기관 | 시료: 인간 혈장/혈청
“이 키트로 분리된 엑소좀을 분석한 결과 질병 마커 후보 단백질이 확인되었습니다.”
대학-의과대학 | 시료: 인간 소변
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엑소좀의 분리 및 정제
엑소좀의 분리 및 정제 (대용량 시료용)
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