MP Biomedicals社　マイコプラズマ検出キット

MP Biomedicals社では、各種マイコプラズマ検出キットをラインアップしています。 いずれも試薬は使いやすいプレミックスタイプで、短時間で幅広いマイコプラズマ種を高感度に検出できます。

	Myco-Visible Mycoplasma PCR Detection Kit	Myco-Visible Mycoplasma LAMP Detection Kit	Myco-Visible Mycoplasma Rapid Test Kit	Myco-Sniff-Rapid Mycoplasma Luciferase Detection Kit
検出方法	エンドポイントPCR	LAMP	イムノクロマト法	ルシフェラーゼアッセイ
所要時間	3時間	45分	1時間	20分
感度	10 CFU/mL	1反応あたり ・10 fg ゲノムDNA ・10ゲノムコピー(16S rRNA)	1反応あたり ・10 CFU/mL ・10 fg ゲノムDNA	高い
特異性	とても高い	とても高い	とても高い	高い

Myco-Visible Mycoplasma PCR Detection Kitは、エンドポイントPCRにより、細胞培養におけるマイコプラズマ汚染高感度・高特異性・かつ簡単に3時間以内で検出できます。
本キットは、第十八改正日本薬局方で検出対象とされる7菌種を含むモリクテス綱に特有のゲノム領域を標的としており、検出限界は1反応あたり10 CFU/mL、または10フェムトグラムのマイコプラズマゲノムDNAです。また、陰性反応とPCR阻害を区別するためのインターナルコントロール(バンドのサイズで陽性サンプルのバンドと区別が可能)および、陽性コントロール(陽性サンプルと同じバンドサイズ)が含まれています。

特長

• 一般的なPCR用の機器・消耗品とアガロースゲルで検出
• 日本薬局方の7菌種を含むマイコプラズマ属菌200種以上を 3時間で検出
• 10 CFU/mL、または10 fgのマイコプラズマゲノムDNAを検出
• 真核生物、その他の細菌のDNAとの交差性なし
• インターナルコントロールにより、偽陰性判定を回避(陰性反応とPCR阻害を区別)

試験結果の解釈

本キットはマイコプラズマ特異的な配列(270 bp)とインターナルコントロールの配列(510 bp)の両方を検出することで、細胞培養液中のマイコプラズマを迅速・正確に検出できます。

使用例 ～感度試験および特異性試験～

CHO細胞培養液に10 CFU/mLのマイコプラズマ属菌株を添加したものをサンプルとしたところ、 8菌種すべて(第十八改正日本薬局方で検出対象とされる7菌種を含む)をMyco-Visible Mycoplasma PCR Detection Kitで検出することができた。
また、同じくCHO細胞培養液にマイコプラズマ以外の細菌を添加したところ、8菌種すべてで交差性がないことが確認できた。

フローチャート

1. Step 1: サンプルの調製

   

2. Step 2: Reaction Mixの調製

   • Reaction Mix	Volume (uL)
     2X PCR Master Mix Primer Mix Sample / Control* Nuclease-free water	12.5 2.5 Up to 5/1 X (total 25 uLになるよう)

     *Positive control (PC) と no template control (NTC)には、
     キットコンポーネントの「Positive Control」と
     「Nuclease-free water」を 1 uL 使用してください

   • 

3. Step 3: マイコプラズマ検出

   

   

トラブルシューティング

インターナルコントロールのバンド(510bp)が検出されない

考えられる原因	対処法
陽性サンプル(マイコプラズマ)の濃度が高すぎる	競合により、マイコプラズマ特異的な配列(270bp)のみが検出されている可能性があります。DNA テンプレートを希釈して再度 PCR を行うとインターナルコントロールのバンドが検出される場合があります。
テンプレートDNAサンプルの状態	サンプル調製時の不純物により PCR 反応が阻害される場合、希釈したサンプルを使用することが有効な手段になることがあります。 マスターミックス/プライマーミックスは適切な条件で保存してください。使用中は試薬を氷上で保管してください。
サーマルサイクラーの設定	プログラムが正しいことを確認してください。

ポジティブコントロールにおいて、インターナルコントロールのバンド(510bp)は検出されるが、マイコプラズマのバンド(270bp)が検出されない

考えられる原因	対処法
ポジティブコントロール/陽性サンプルの分解	ポジティブコントロール/陽性サンプルを－20℃で保管し、凍結融解の繰り返しは避けてください。
サーマルサイクラーの設定	プログラムが正しいことを確認してください(特にアニーリング温度)。

ネガティブコントロールにおいて、マイコプラズマのバンド(270bp)が検出される

考えられる原因	対処法
試薬の汚染	ネガティブコントロールとして新しい無菌水を使用し、再度の実験をしてください。キットのコンポーネントの汚染を確認してください。
実験器具/実験環境の汚染	コンタミネーションのリスクを減らすためにフィルター付きチップを使用し、使用前にはピペットを滅菌してください。すべての操作は、汚染物質および PCR 産物から隔離された専用エリアで実施してください。

アガロースゲルでの解像度が低い

考えられる原因	対処法
ゲルの濃度が低い	1.5 % のアガロースゲルを使用してください。バンドパターンを DNA マーカーと比較して解像度を確認してください。
電気泳動の時間が短い	1.5 % のアガロースゲルを使用し、100 V で25～30 分間電気泳動を行ってください。

Myco-Visible Mycoplasma Rapid Test Kitは、細胞培養中のマイコプラズマ汚染を高感度・高特異性で迅速に検出できる検査キットです。LAMP技術を採用しており、第十八改正日本薬局方で検出対象とされる7菌種を含むマイコプラズマゲノム特有の保存領域をターゲットとし、増幅することで検体を調製します。検査結果は検体添加後5分以内に、免疫クロマトグラフィー検査装置上で視覚化できます。
この検査は1時間で完了し、検出限界は1反応あたり10 CFU/mL、または10 fgマイコプラズマゲノムDNAです。特異性試験により、他の細菌、真菌、または哺乳類のDNAとの交差反応がないことが確認されています。

特長

• 高感度・高精度：10 CFU/mLまたは10 fgのgDNAを含むマイコプラズマ汚染を検出可能
  (日本薬局方で検出対象とされる7菌種を含む90種類以上のマイコプラズマ)
• 迅速：1時間以内に試験結果が判明
• 簡便な操作：専門機器や技術的な知識が不要で、操作も簡単
• 高い特異性・交差反応なし：偽陽性を排除し、他の細菌、真菌、または哺乳類のDNAとの交差反応がないため、信頼性の高い結果を保証します。

試験結果の解釈

• バンドが1本(Cバンドのみ)：マイコプラズマ「陰性」
• バンドが2本(CバンドとTバンド)：マイコプラズマ「陽性」

注：テストバンド(Tバンド)が薄くてもマイコプラズマ陽性と判断されます。コントロールバンド(Cバンド)がない場合は、試験は無効です。
注：Cバンドは1～2分で出現します。陽性の場合は、 Tバンドが5分以内に検出されます。5分経過後もTバンドが検出されない場合は、検査は陰性です。20分経過後にバンドが出現した場合は、バンドが長時間空気にさらされたことにより不安定になっていた可能性があるため、無効とみなしてください。

使用上の注意

• 試薬は4 °Cまたは室温で解凍してください。検出装置とランニングバッファーは使用前に室温に戻してください。
• プライマーミックス（例：5 x 22 μL）とポジティブコントロール（例：5 x 10 μL）は、最初の使用時に分注して保存することを強く推奨します(頻繁な凍結解凍と汚染を防止するため)
• 操作前に作業エリアを70 %アルコールまたは10 %家庭用漂白剤で清掃してください。
• 反応混合液の調製は、LAMPインキュベーションと検出装置の場所から分離された専用の清潔なエリアで行ってください。インキュベーション後の反応チューブを反応混合液の調製を行う場所に戻さないでください。
• 常に無菌でヌクレアーゼフリーのフィルター付きピペットチップを使用してください。
• サンプル、増幅産物、使用済みの消耗品は、廃棄前に滅菌する必要があります。

フローチャート

1. Step 1: サンプルの調製

   

2. Step 2: Reaction Mixの調製

   • Reaction Mix	Volume (uL)
     Primer Mix Sample / Control* Nuclease-free water	4 Up to 4 / 1 X (total 20 uLになるよう)

     *Positive control (PC) と no template control (NTC)には、
     キットコンポーネントの「Positive Control」と
     「Nuclease-free water」を 1 uL 使用してください

   • 

3. Step 3: マイコプラズマ検出

   

使用例 ～分析感度評価と特異性評価～

【マイコプラズマの分析感度評価】

分析感度を評価するため、7種類のマイコプラズマ属から100および10 CFU/mLに希釈した不活化マイコプラズマを、1 x 10⁶ CHO細胞/mLの細胞懸濁液を加えたサンプルを用いました。本キットの検出限界（10 CFU/mL）は、EP/USP/JPで規定された核酸増幅技術（NAT）に基づくマイコプラズマ検出法の感度ガイドラインを満たしています。

マイコプラズマ7菌種すべてが100 CFU/mLおよび10 CFU/mLで陽性結果を示しました。
NTC(陰性対照)は、ヌクレアーゼフリー水です。

使用例 ～分析感度評価と特異性評価～

【非マイコプラズマ種を用いた特異性評価】

本キットは、他の細菌、真菌、または哺乳類のDNAとの交差反応なしにマイコプラズマを特異的に検出します。この特異性試験では、さまざまなオフターゲット種から精製されたgDNA（1 x 10⁵コピー/反応）を評価しました。すべての種で陰性結果を示し、交差反応がないことを示しました。

• NTC: No template control
• 1: Bacillus subtilis
• 2: Candida albicans
• 3: Listeria monocytogenes
• 4: Salmonella typhimurium
• 5: Staphylococcus epidermidis
• 6: Micrococcus luteus
• 7: Bacillus cereus
• 8: Pseudomonas aeruginosa
• 9: Staphylococcus Aureus
• 10: Escherichia coli
• 11: Human blood
• 12: Mouse tail
• 13: CHO cell
• 14: hMSC cell
• 15: Saccharomyces cerevisiae
• 16: Pichia pastoris
• PC: Positive Control

トラブルシューティング

no template control (NTC)でバンドが2本検出される

考えられる原因	対処法
反応時間が長すぎる	インキュベートの時間を超過しないでください(70 ℃で40分間)。 ※反応に重大な影響を及ぼします。
キャリーオーバー(試薬の汚染)	使用中の小分けした試薬を廃棄し、新しいものを使用してください。 試薬の調製は、汚染のない専用環境で行い、インキュベートおよび試験結果を確認する場所から分離した場所で実施してください。 フィルターチップを使用してください。

ポジティブコントロールにおいて、コントロールバンド(Cバンド)だけが検出される

考えられる原因	対処法
試薬の劣化	Primer MixおよびPositive Controlを頻繁に凍結融解しないようにしてください。
添加した Positive Control (#093050906) の DNA 量が少ない	テンプレートの添加量を増やしてください(最大5uL)。 細胞培養の時間を48時間伸ばして再試験をしてみてください。 初回のLAMP生産物をテンプレートとして、再度 LAMP 反応を行ってください。 使用するコンポーネントは使用前に室温に戻してください。 試薬は分注して保存し、凍結融解の繰り返しは避けてください。 保管温度が適切か確認してください。

バンドが検出されない

考えられる原因	対処法
Detection Deviceの劣化	Detection Deviceを適切な条件下で保管してください。 使用前にDetection Deviceを室温に戻してください。 Detection Device は開封後1時間以内に使用してください
Running Bufferのコンタミネーション	Running Bufferが適切に保管され、汚染されていないことを確認してください。

テストバンド(Tンド)が薄い

考えられる原因	対処法
軽度のコンタミネーション	薄いピンク色のTバンドが検出され、NTCが検出されない場合、陽性と判定されます。 テストサンプルとNTCの両方で薄いTバンドが検出された場合、コンタミネーションによる試験無効と判定されます。

Myco-Visible Mycoplasma LAMP Detection Kitは、細胞培養におけるマイコプラズマ汚染の検出を目的とした高感度、迅速で特異的なアッセイキットです。
Myco-Visible Mycoplasma LAMP Detection Kitにより、Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma arginini, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma pneumoniaeを含むモリクテス綱(マイコプラズマやウレアプラズマ)の 16S rRNA コード領域を増幅します。
1反応あたり 10コピーの16S rRNAコード領域、 または 10 fg のマイコプラズマゲノムDNA で45 分以内に検出できます(サーマルサイクラー不要)。 Primer-BLAST による他の細菌、真菌、哺乳動物の DNA との交差反応性はありません。 色の変化(ピンク色から黄色)により、簡単に陽性の判定ができます。

特長

• 特別な機器は不要：ドライバスだけで直接検出
• 迅速かつ包括的：マイコプラズマ属菌を 45 分で検出
• 高感度：1反応あたり 10コピーの16S rRNAコード領域、または 10 fg のマイコプラズマゲノムDNA を検出
• 使いやすさ: 革新的な比色検出システム - 鮮やかな色の変化

キット内容

• Master Mix
• Primer Mix
• Nuclease-free water
• Positive control

陽性/陰性の判定

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使用例 ~Myco-Visible Mycoplasma LAMP Detection Kitの分析感度試験~

8つのマイコプラズマ属菌株(第十八改正日本薬局方で検出対象とされる7菌種を含む)を使用して、10~10^3 コピー/uLの 10 倍段階希釈を行ったところ、10コピーの16S rRNAコード領域、または 10 fg のマイコプラズマゲノムDNAを検出できました。

フローチャート

Myco-Sniff-Rapid Mycoplasma Luciferase Detection Kitは、細胞培養物中のマイコプラズマ汚染を20 分間で簡便かつ高感度に検出できるキットです。
本キットでは、ほとんどのマイコプラズマ種が持つマイコプラズマ代謝酵素の活性を利用します。 この酵素は真核細胞には存在しないため、マイコプラズマを特異的に検出できます。
マイコプラズマ存在下では、酵素は基質と反応して、ADP から ATP への変換を触媒します。 マイコプラズマ汚染は、ルシフェラーゼアッセイによる Myco-Sniff-Rapid 基質の添加前後のサンプル中の ATP レベルを測定することで検出できます。

注：検出には別途ルミノメーター(発光測定装置)が必要です。

特長

• 迅速：20 分で結果が得られる
• 高感度
• マイコプラズマに特異的
• 細胞培養培地成分への干渉なし
• 簡便な操作 - 培養上清に試薬を直接添加するだけ

キット内容	#3050401 (25 tests)	#3050402 (50 tests)
Myco-Sniff-Rapid Reagent (凍結乾燥品)	2本	4本
Myco-Sniff-Rapid Substrate (凍結乾燥品)	2本	4本
Myco-Free Water	1.5 mL×2本	1.5 mL×4本