抗腸内細菌抗体

ヒトの腸内には細菌をはじめとするさまざまな種類の微生物が存在しており、生息環境に適応した多様なマイクロバイオータ (腸内細菌叢) を形成しています。マイクロバイオータの構成や代謝産物はがん、糖尿病、肥満、アレルギー、神経精神疾患などさまざまな疾患に関与することが報告されており、ヒトの健康との関連が注目されています。
特に日本人に多く存在する腸内細菌としてフォカエイコラ・ブルガタス、フィーカリバクテリウム・ダンカニエ、セガテラ・コプリなどが知られています。これらの細菌の構成比を調べ、腸内細菌叢のエンテロタイプを特定することで、対象の腸内環境を理解することができます。このような腸内細菌の解析は主に次世代シークエンス (NGS) が利用されていますが、労力やコストが課題となっています。
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 國澤 純 先生、吉井 健 先生らの研究グループは迅速・安価で簡便な腸内細菌の検出法の開発に取り組み、上記の腸内細菌を認識するモノクローナル抗体を開発しました¹⁾。それぞれの細菌をマウスに直接免疫するノンターゲット戦略により各種細菌を認識することができます。

当社では以下3種類の腸内細菌に対する抗体をラインアップしています。

腸内細菌	フォカエイコラ・ブルガタス (Phocaeicola vulgatus)			フィーカリバクテリウム・ダンカニエ (Faecalibacterium duncaniae)			セガテラ・コプリ (Segatella copri)
細菌の概要	旧名 バクテロイデス・ブルガタス (Bacteroides vulgatus)。代謝や免疫機能をサポート。通常は共生菌だが、特定条件下で病原性を示す。本属に関する研究は、腸内細菌叢による健康維持や疾患予防に繋がることが期待されている。			旧名 フィーカリバクテリウム・プラウスニッチ(Faecalibacterium prausnitzii)。ヒトや動物の腸内に生息する嫌気性細菌。短鎖脂肪酸を生成することが知られており、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患への関連などが報告されている。			旧名 プレボテラ・コプリ (Prevotella copri )。さまざまな部位に生息するグラム陰性細菌。歯周病、炎症性腸疾患、細菌性膣炎などに関連する可能性が示唆されている。
コードNo.	013-28931	010-28941	017-28951	012-28901	019-28911	016-28921	014-28961	011-28971
クローンNo.	PV-L2B7-117K1	PV-L1A6-117K2	PV-S10F7-14K1	FD-S2D3-18K1	FD-L4F6-18K2	FD-L5B6-33K2	SC-S10C3-49K1	SC-L10B5-35K1
サブクラス	IgG2b	IgG2b	IgG3	IgG2b	IgG2b	IgG2b	IgG2a	IgG2a
免疫動物	マウス
組成	1 x D-PBS、0.05% アジ化ナトリウム
アプリケーション	ELISA (ダイレクト/サンドイッチ※)、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロッティング

サンドイッチELISAによる各種腸内細菌の定量とNGS (16S rRNA遺伝子) との比較

ヒト糞便 3検体について、抗腸内細菌抗体を組み合わせたサンドイッチELISAにより菌数を測定した。またサンドイッチELISAとNGSによる16S rRNA遺伝子のアンプリコンシークエンスで得られた腸内細菌の構成比を比較した。

サンドイッチELISAの構成

(1) P. vulgatus
捕捉抗体: PV-L1A6-117K2
検出抗体: PV-L2B7-117K1

(2) F. duncaniae
捕捉抗体: FD-S2D3-18K1
検出抗体: FD-L4F6-18K2

(3) S. copri
捕捉抗体: SC-S10C3-49K1
検出抗体: SC-S10C3-49K1

腸内細菌数の測定 (サンドイッチELISA)

• Phocaeicola vulgatus
• Faecalibacterium duncaniae
• Segatella copri

NGS (16S rRNA遺伝子) との比較

• Phocaeicola vulgatus
• Faecalibacterium duncaniae
• Segatella copri

ELISA

96ウェルマイクロプレートに細菌溶液100 μLを添加し、コーティングした。細菌溶液は凍結乾燥した熱殺菌細菌をPBSで希釈する、もしくはB-PER溶液に懸濁し、ガラスビーズで破砕することで調製した。抗原固相化プレートのブロッキングおよび洗浄を行った後、ハイブリドーマ 各クローンの細胞培養上清を添加し、2時間インキュベートした。抗原に結合した抗腸内細菌抗体はHRP標識ヤギ抗マウスIgGを用いて検出した。

• P. vulgatus
• F. duncaniae
• S. copri
• B. pseudocatenulatum
• B. longum
• B. wexlerae
• A. muciniphila

フローサイトメトリー

細菌をファーマー固定液 (エタノール:酢酸=7:3) で固定後、遠心分離(13,040 x g, 2分, 4 °C) を行った。細菌 100 μLと抗腸内細菌抗体 1 μgを1% BSAを含むPBS-Tに懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄後、FITC標識抗マウスIgGを添加し、30分間、氷上、暗所で反応させた。染色された細菌を洗浄し、フローサイトメーターで解析した。

Anti-P. vulgatus

Anti-F. duncaniae

Anti-S. copri

データは著作者の許諾を得て、文献1)を元に作成

ウエスタンブロッティング

各腸内細菌を10,000 x gで5分間 遠心分離して回収後、タンパク質 2 µgをSDS-PAGEにて分離した。分離したタンパク質はPVDF膜に転写し、ブロッキング後、25-50 ng/mLの抗腸内細菌抗体およびHRP標識マウスIgGを用いて検出した。

サンプルは以下、腸内細菌の抽出液を使用
P. vulgatus : Phocaeicola vulgatus JCM5826
F. duncaniae : Faecalibacterium duncaniae JCM31915
S. copri : Segatella copri JCM13464

データは著作者の許諾を得て、文献1)を元に作成

1. Yoshii, K. et al.: Sci. Rep., 15(1), 1(2025).
   Establishment of enterotype-specific antibodies for various diagnostic systems