CRISPR/Cas9による遺伝子改変動物作製
2013年に登場した『CRISPR/Casシステム』は、哺乳培養細胞やあらゆる動物のゲノムを編集できるシステムとして、瞬く間にライフサイエンスの中心技術となりました。短期間の内に遺伝子変異モデル動物を作製できます。またこれまで作製することが非常に困難であったラット等の動物種にも利用できます。
特殊免疫研究所ではBroad InstituteよりCRISPR/Cas9システムの使用ライセンスを所得しています。
特長
- ノックアウト/ノックイン動物作製可能
- 塩基置換モデル動物が作成可能
- マウスのほかラットにも対応
- ヒトcDNAを内在性遺伝子の発現制御領域につなげるよう挿入することが可能_ヒト化モデル作製
- ラットやマウスの受精卵を用いてレポーター遺伝子を目的の領域に挿入可能_オリジナルのレポーター動物の樹立
- ラットやマウスの受精卵を用いてCre（またはCreERT2）を目的の領域に挿入可能_様々なCre発現動物の作製が可能
- floxラット、マウスの迅速な作製・樹立（ご依頼者のご希望に沿ったfloxのデザインが可能）
- 1から10kb程度のサイズの遺伝子導入が可能（10kb以上は要相談）
依頼に必要な情報
- 標的遺伝子情報
- 動物種＆ご希望の系統
＊ノックアウトの場合は、遺伝子破壊方法をご相談の上デザインさせていただきます。
＊ノックインの場合は、挿入するDNAや場所をご相談の上デザインさせていただきます。
作業フロー、価格、納期
遺伝子変異 indel & SSODN挿入 (SNPsモデル) タイプ作製
| 作業 工程 |
内容 | 希望納入価格 （マウス） |
希望納入価格 （ラット） |
作業期間 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 受精卵への注入物質の準備
gRNA、ssODN配列設計（使用系統の配列確認）
Cas9タンパク（or mRNA）の準備（切断活性試験_要相談） Cas9タンパク（or mRNA）、gRNA、ssODNの調製 |
45万円 | 1ヶ月程度 | |
| 2 | Cas9、gRNA（およびssODN）導入作業
100個処理
|
40万円から | 50万円から | 1.5ヶ月程度 |
| 3 | 胚移植（レシピエント動物作製）から産仔離乳
胚移植
産仔の出産、7週齢まで維持、離乳およびTail Biopsy |
40万円から | 50万円から | |
| 4 | 遺伝型解析
PCR、surveyor解析等による変異体検出
シークエンス解析（3検体まで） |
45万円 | 0.5ヶ月前後 | |
| 総額 | 170万から | 190万から | ||
- 納期：3ヶ月前後（作業工程１から４まで）
- 納品物：取得ファウンダー個体すべて
（系統化をご依頼された場合は、ファウンダー個体と後代個体）
作業報告書
＊工程の一部（2と3のみ）のご依頼も可能（要相談）
＊ファウンダー個体取得後の系統化、生産供給、系統保存等のサービスもご提供しております。
遺伝子変異 ノックイン (LssDNA & dsDNA) タイプ作製
| 作業 工程 |
内容 | 希望納入価格 （マウス） |
希望納入価格 （ラット） |
作業期間 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 受精卵への注入物質の準備
gRNA、ドナーDNA配列設計（使用系統の配列確認）
Cas9タンパク（or mRNA）の準備（切断活性試験含） Cas9タンパク（or mRNA）、gRNA、ドナーDNAの調製 |
60万円から | 1.5ヶ月程度 | |
| 2 | Cas9、gRNA（およびcDNA等）導入作業
200個処理
|
60万円から | 70万円から | 1.5ヶ月程度 |
| 3 | 胚移植（レシピエント動物作製）から産仔離乳
胚移植
産仔の出産、7週齢まで維持、離乳およびTail Biopsy |
65万円から | 85万円から | |
| 4 | 遺伝型解析
PCR-RFLP解析による変異体検出
シークエンス解析（3検体まで） |
55万円から | 1ヶ月以上 | |
| 総額 | 240万から | 270万から | ||
納期：4～5ヶ月（作業工程１から４まで）
納品物
- 取得ファウンダー個体すべて
（系統化をご依頼された場合は、ファウンダー個体と後代個体） - 作業報告書
＊工程の一部（2と3のみ）のご依頼も可能（要相談）
＊ファウンダー個体取得後の系統化、生産供給、系統保存等のサービスもご提供しております。
作製事例
実施例: CRISPR/Cas9 システムを用いたROSA KIラット作製
作業条件
ラット系統: Long-Evans系、Wistar系、SD系、
標的遺伝子: ROSA遺伝子座
注入条件: Cas9mRNA/gRNA/plasmid
遺伝型解析: PCRスクリーニング、および蛍光確認
作業結果
ノックインラット・マウス作製実績
| サイズ | 用途 | 導入方法 | 実績 | |
|---|---|---|---|---|
| 一本鎖DNA ssODN |
200bp以下 | SNPsモデル Tagや終止codon挿入 LoxP導入 |
マイクロインジェクション | いずれも ◎ |
| エレクトロポレーション | ||||
| 長鎖一本鎖DNA LssDNA |
200bp～1kb前後 | Cre遺伝子 レポーター遺伝子 エクソン |
マイクロインジェクション | 〇 |
| エレクトロポレーション | △ | |||
| 二本鎖DNA dsDNA |
2kb以上 | ヒトcDNA等 | マイクロインジェクション | ◎ |
| エレクトロポレーション | × |
二本鎖DNAのサイズにつきましては10bk以上となります場合は要相談とさせていただきます。
一塩基置換ノックインラット作製
実験条件
ラット系統 Wistar系
標的遺伝子 ROSA
注入条件 Cas9mRNA/gRNA/ssODN
100/50/100（ng/μL）
受精卵細胞質注入
| 注入数 | 生存数 | 移植数 | 産仔数 |
|---|---|---|---|
| 141個 | 131個 | 122個 | 35匹 |
Rosa領域に点変異（EcoRV）を挿入したノックインラット（ホモ個体）のシークエンス確認結果 シークエンスサンプル： ホモ候補のゲノムDNAをテンプレートにPCRを行い、得られたPCRプロダクトをダイレクトシークエンスした。
遺伝型解析 ssODNとして導入した制限酵素
サイトを利用
PCRスクリーニング
実験結果 変異体取得35 匹中 12 匹（移植胚あたりで約10 %）
ノックイン個体10 匹（●） そのうち2 匹がホモ変異体（●）
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